Получение кроликов с нокаутом гена LEPR с помощью системы CRISPR/CAS9

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Мутации в гене LEPR, кодирующем рецептор гормона лептина, у человека приводят к развитию морбидного ожирения, нарушению обмена липидов, дефектами фертильности. У грызунов описаны спонтанные мутации в гене Lepr, а также получены животные с нокаутом LEPR, в том числе с помощью системы CRISPR/Cas9. Особенности липидного обмена у грызунов существенно отличаются от таковых у человека или кроликов, поэтому наиболее релевантной моделью нарушений липидного обмена и морбидного ожирения являются кролики, однако до настоящего времени не сообщалось о получении кроликов с нокаутом гена LEPR. В данной работе с помощью системы CRISPR/Cas9 за счет внесения делеции в области 10 экзона был получен кролик с нокаутом гена LEPR. Показано, что вес нокаутного кролика был существенно выше среднего веса кроликов дикого типа. Технология получения кроликов c нокаутом LEPR с помощью CRISPR/Cas9 позволит создать модель морбидного ожирения и эндокринных нарушений, обусловленных мутациями в гене рецептора лептина человека.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Ю. Ю. Силаева

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: mshepelev@mail.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Россия, Москва

П. Д. Сафонова

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, Москва

Д. В. Попов

Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, пос. Родники, Московская область

М. А. Филатов

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: mshepelev@mail.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Россия, Москва

Ю. Д. Окулова

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: mshepelev@mail.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Россия, Москва

Р. А. Шафеи

Московский Государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, Москва

О. И. Скобель

Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, пос. Родники, Московская область

Д. Э. Высоцкий

Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, пос. Родники, Московская область

Ю. Д. Губарев

Белгородский государственный национальный университет

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, Белгород

В. И. Глазко

Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, пос. Родники, Московская область

Т. Т. Глазко

Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, пос. Родники, Московская область

П. Г. Георгиев

Институт биологии гена Российской академии наук

Email: mshepelev@mail.ru

академик РАН

Россия, Москва

Г. Ю. Косовский

Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева

Email: mshepelev@mail.ru
Россия, пос. Родники, Московская область

М. В. Шепелев

Институт биологии гена Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: mshepelev@mail.ru

Центр высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины

Россия, Москва

Список литературы

  1. Алипкина С.И. et al. Лептин и его рецептор в норме и при патологии // Успехи Современной Биологии. 2019. Vol. 139. P. 352–364.
  2. Friedman J.M. Leptin and the endocrine control of energy balance // Nat Metab. 2019. Vol. 1, № 8. P. 754–764.
  3. Schaab M., Kratzsch J. The soluble leptin receptor // Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2015. Vol. 29, № 5. P. 661–670.
  4. Berger C., Klöting N. Leptin Receptor Compound Heterozygosity in Humans and Animal Models // Int J Mol Sci. 2021. Vol. 22, № 9. P. 4475.
  5. Israel D., Chua S. Leptin receptor modulation of adiposity and fertility // Trends Endocrinol Metab. 2010. Vol. 21, № 1. P. 10–16.
  6. Iikuni N. et al. Leptin and Inflammation // Curr Immunol Rev. 2008. Vol. 4, № 2. P. 70–79.
  7. Pennington K.A. et al. Conditional knockout of leptin receptor in the female reproductive tract reduces fertility due to parturition defects in mice // Biol Reprod. 2022. Vol. 107, № 2. P. 546–556.
  8. Coleman D.L. Obese and diabetes: two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice // Diabetologia. 1978. Vol. 14, № 3. P. 141–148.
  9. Zhang Y. et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue // Nature. 1994. Vol. 372, № 6505. P. 425–432.
  10. Chen H. et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice // Cell. 1996. Vol. 84, № 3. P. 491–495.
  11. McMinn J.E. et al. An allelic series for the leptin receptor gene generated by CRE and FLP recombinase // Mamm Genome. 2004. Vol. 15, № 9. P. 677–685.
  12. Cohen P. et al. Selective deletion of leptin receptor in neurons leads to obesity // J Clin Invest. 2001. Vol. 108, № 8. P. 1113–1121.
  13. McMinn J.E. et al. Neuronal deletion of Lepr elicits diabesity in mice without affecting cold tolerance or fertility // Am J Physiol Endocrinol Metab. 2005. Vol. 289, № 3. P. E403-411.
  14. Gogiraju R. et al. Deletion of endothelial leptin receptors in mice promotes diet-induced obesity // Sci Rep. 2023. Vol. 13, № 1. P. 8276.
  15. Morioka T. et al. Disruption of leptin receptor expression in the pancreas directly affects beta cell growth and function in mice // J Clin Invest. 2007. Vol. 117, № 10. P. 2860–2868.
  16. Guo K. et al. Disruption of peripheral leptin signaling in mice results in hyperleptinemia without associated metabolic abnormalities // Endocrinology. 2007. Vol. 148, № 8. P. 3987–3997.
  17. Wu-Peng X.S. et al. Phenotype of the obese Koletsky (f) rat due to Tyr763Stop mutation in the extracellular domain of the leptin receptor (Lepr): evidence for deficient plasma-to-CSF transport of leptin in both the Zucker and Koletsky obese rat // Diabetes. 1997. Vol. 46, № 3. P. 513–518.
  18. Bao D. et al. Preliminary Characterization of a Leptin Receptor Knockout Rat Created by CRISPR/Cas9 System // Sci Rep. 2015. Vol. 5. P. 15942.
  19. Matsuhisa F. et al. Transgenic Rabbit Models: Now and the Future // Applied Sciences. 2020. Vol. 10, № 21.
  20. Maslennikova A. et al. Engineering T-Cell Resistance to HIV-1 Infection via Knock-In of Peptides from the Heptad Repeat 2 Domain of gp41 // mBio. 2022. Vol. 13, № 1. P. e0358921.
  21. Sakurai T. et al. A single blastocyst assay optimized for detecting CRISPR/Cas9 system-induced indel mutations in mice // BMC Biotechnol. 2014. Vol. 14. P. 69.
  22. Green M.R., Sambrook J. Preparation of Genomic DNA from Mouse Tails and Other Small Samples // Cold Spring Harb Protoc. 2017. Vol. 2017, № 9. P. pdb.prot093518.
  23. Абрашова Т.В. et al. // СПРАВОЧНИК. Физиологические, биохимические и биометрические показатели нормы экспериментальных животных. СПб: ЛЕМА, 2013. P. с.15.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис.1. Разработка технологии нокаута гена LEPR кроликов с помощью системы CRISPR/Cas9. (а) Результаты секвенирования по Сэнгеру мишени для sgLepr-2 в геноме кролика. SNP A/T в 20 позиции протоспейсера указан стрелкой. Снизу от хроматограммы приведена нуклеотидная последовательность мишени для sgLepr-2, включающая протоспейсер и сайт PAM. (б) Результаты in vitro теста на расщепление ДНК-субстрата. Продукт ПЦР длиной 642 п.о. инкубировали с SpCas9 РНП, содержащим sgLepr-2 или контрольную гидовую РНК, не имеющую мишеней в геноме кролика (sgScr). Расщепление ДНК-субстрата с образованием фрагментов ожидаемого размера (340 и 302 п.о.) отмечалось только под влиянием sgLepr-2. Дорожка “Mw” – маркер длины фрагментов ДНК – O’GeneRuler 50bp DNA Ladder (“Thermo Scientific”, SM1133). Длина некоторых полос маркера обозначена справа от рисунка. Фото эмбрионов кролика до проведения микроинъекций (в) и через 120 часов после микроинъекций смеси реагентов для геномного редактирования (г). Снимки эмбрионов, находящихся в чашках Петри в культуральной среде, получали с помощью микроскопа Nikon SMZ-800 (Япония).

Скачать (237KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Эффективное редактирование гена LEPR в эмбрионах кролика. (а) Результаты гетеродуплексного анализа продуктов амплификации на матрице геномной ДНК из шести эмбрионов кролика (1–6), инъецированных смесью мРНК SpCas9 и sgLepr-2. 5 мкл реакции ПЦР разделяли в 8%-ом полиакриламидном геле. Дорожка “Mw” – маркер длины фрагментов ДНК – O’GeneRuler 50bp DNA Ladder. Длина некоторых полос маркера обозначена справа от рисунка. (б) Результаты секвенирования по Сэнгеру образцов #2 и #3. Вертикальная пунктирная черта и красный треугольник указывают место разрезания генома нуклеазой SpCas9. Генотип SNP (А) показан над пиком хроматограммы. (в) Результаты ICE анализа хроматограмм секвенирования по Сэнгеру образцов #2 и #3. Нуклеотидные последовательности показывают выявленные инделы. Частоты инделов составляли 92% и 89% для образцов #2 и #3, соответственно.

Скачать (247KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Молекулярно-генетический анализ кролика с нокаутом LEPR. (а) Анализ продуктов ПЦР, амплифицированных на матрице геномной ДНК кролика дикого типа (дорожка wt) и с нокаутом гена LEPR (дорожка «KO»), с помощью электрофореза в 8%-ом акриламидом геле. Полоса длиной 642 п.о. амплифицируется на матрице геномной ДНК дикого типа; полоса длиной 356 п.о. присутствует только в образце “KO”. Длины полос маркера молекулярного веса ДНК O’GeneRuler 50 bp DNA Ladder (“ThermoFisher Scientific”, США) указаны справа. Положение соответствующих продуктов ПЦР указано стрелками. (б) Схема геномного локуса LEPR дикого типа (wt) в области 10 и 11 экзонов, имеющих длину 291 и 118 п.о. соответственно. Положение олигонуклеотидных праймеров “F” и “R” показано в виде стрелок. На панели “KO” показана схема геномного локуса LEPR генно-модифицированного кролика. Место внесения двуцепочечного разрыва в геноме кролика с помощью нуклеазы SpCas9 и гидовой РНК sgLepr-2 показано красным треугольником. (в) Результат секвенирования по Сэнгеру продукта ПЦР длиной 356 п.о. Под нуклеотидной последовательностью указана трансляция открытой рамки считывания транскрипта XM_051856399, транскрибирующегося с нокаутного алелля. С 1 по 450 аминокислоту транслируется последовательность белка Lepr дикого типа (подчеркнуто зеленым), далее за счет инсерции случайных 9 п.о. TTTAAAGTA транслируется бессмысленный пептид FKVVPCS (non-sense, подчеркнут красным), после чего следует кодон терминации трансляции TGA (показан рамкой).

Скачать (269KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Динамика набора массы тела кроликом с нокаутом гена LEPR. (a) Фото генно-модифицированного кролика в возрасте около двух недель. (б) График набора массы тела кроликом с нокаутом гена LEPR (“LEPR KO”) по сравнению со средней массой тела кроликов породы советская шиншилла дикого типа (“wt”).

Скачать (133KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2024