Экспрессия фарнезилированного EGFP в нейронах первичной культуры неокортекса приводит к нарушению развития дендритных шипиков

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Генетически кодируемые флуоресцентные белки широко используются в биологических исследованиях вообще и в нейробиологии в частности. При использовании этих инструментов важно, чтобы экспрессия флуоресцентного белка не нарушала протекание естественных физиологических процессов в клетке. Добавление мотива фарнезилирования к флуоресцентным белкам приводит к их заякориванию в плазматической мембране, что часто используется для визуализации тонких деталей морфологии клетки, например дендритных шипиков. В нашей работе мы исследовали развитие шипиков в первично культивируемых нейронах неокортекса при трансфекции клеток фарнезилированным и немодифицированным EGFP методом электропорации в суспензии в день посадки. Было обнаружено, что нейроны, экспрессирующие фарнезилированный EGFP, демонстрируют выраженные нарушения в развитии шипиков, в частности эти клетки характеризовались более длинными шипиками с большим количеством филоподия-подобных структур, что характерно для различных патологических состояний. Поэтому при использовании фарнезилированных флуоресцентных белков в экспериментах необходимо учитывать их возможное негативное влияние на развитие различных мембранных структур клетки, в частности нейрональных шипиков.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

Г. Р. Смирнова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Email: malyshev@ihna.ru
Россия, Москва

О. С. Иджилова

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Email: malyshev@ihna.ru
Россия, Москва

А. Абонакур

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Email: malyshev@ihna.ru
Россия, Москва

А. Ю. Малышев

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН

Автор, ответственный за переписку.
Email: malyshev@ihna.ru
Россия, Москва

Список литературы

  1. Day R.N., Davidson M.W. // Chem. Soc. Rev. 2009. V. 38. P. 2887–2921.
  2. Cranfill P.J., Sell B.R., Baird M.A., Allen J.R., Lavagnino Z., de Gruiter H.M., Kremers G.-J., Davidson M.W., Ustione A., Piston D.W. // Nat. Methods. 2016. V. 13. P. 557–562.
  3. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. // Gene. 1996. V. 173. P. 33–38.
  4. Kostyuk A.I., Demidovich A.D., Kotova D.A., Belousov V. V, Bilan D.S. // Int. J. Mol. Sci. 2019. V. 20. P. 4200.
  5. Craven S.E., El-Husseini A.E., Bredt D.S. // Neuron. 1999. V. 22. P. 497–509.
  6. Grabrucker A.M., Vaida B., Bockmann J., Boeckers T.M. // J. Neurosci. Methods. 2009. V. 181. P. 227–234.
  7. Cane M., Maco B., Knott G., Holtmaat A. // J. Neurosci. 2014. V. 34. P. 2075–2086.
  8. Lim S.T., Antonucci D.E., Scannevin R.H., Trimmer J.S. // Neuron. 2000. V. 25. P. 385–397.
  9. Kitamura A., Nakayama Y., Kinjo M. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2015. V. 463. P. 401–406.
  10. Lu J., Wu T., Zhang B., Liu S., Song W., Qiao J., Ruan H. // Cell Commun. Signal. 2021. V. 19. P. 60.
  11. Амая М., Айзенхабер Б., Айзенхабер Ф., ван Хук М.Л. // Молекулярная биология. 2013. Т. 47. С. 717–730.
  12. Kim A.K., Wu H.D., Inoue T. // Sci. Rep. England, 2021. V. 11. P. 16421.
  13. Watts S.D., Suchland K.L., Amara S.G., Ingram S.L. // PLoS One. 2012. V. 7 P. e35373–e35373.
  14. Rodgers W. // Biotechniques. 2002. V. 32 P. 1044–1051.
  15. Keiser M.S., Chen Y.H., Davidson B.L. // Curr. Protoc. Mouse Biol. 2018. V. 8. e57
  16. Yuste R. Dendritic Spines. The MIT Press, 2010.
  17. Son J., Snng S., Lee S., Chang S., Kim M. // J. Microsc. 2011. V. 241. P. 261–272.
  18. Hayashi Y., Majewska A.K. // Neuron. 2005. V. 46. P. 529–532.
  19. Bourne J., Harris K.M. // Curr. Opin. Neurobiol. 2007. V. 17. P. 381–386.
  20. Fiala J.C., Feinberg M., Popov V., Harris K.M. // J. Neurosci. 1998. V. 18. P. 8900–8911.
  21. Wisniewski K.E., Segan S.M., Miezejeski C.M., Sersen E.A., Rudelli R.D.// Am. J. Med. Genet. 1991. V. 38. P. 476–480.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Морфология дендритных шипиков. а – Схематическое изображение шипика с отображенными параметрами, которые использовались для отнесения шипика к одному из четырех морфологических типов: грибовидный, пенек, тонкий и филоподия. б – Конфокальная микрофотография, демонстрирующая фрагмент дендрита пирамидного нейрона неокортекса мыши, трансдуцированного in vivo адено-ассоциированным вирусом, несущим фарнезилированный EGFP. Калибровка 2 мкм.

Скачать (210KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Культивируемые нейроны, трансфицированные фарнезилированным EGFP, демонстрируют выраженные аномалии развития по сравнению с клетками, экспрессирующими немодифицированный EGFP. а, б – фрагменты дендритов нейронов, экспрессирующих fEGFP (а) и EGFP (в). Стрелками с буквами обозначены примеры шипиков, отнесенных к тому или иному морфологическому классу: Ф – филоподия, Г – грибовидный, П – пенькообразный, Т – тонкий. б, г – тела клеток, трансфицированных плазмидой с fEGFP (б) и EGFP (г). Калибровка 5 мкм.

Скачать (401KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Иммунохимическое окрашивание нейронов, экспрессирующих EGFP и fEGFP, антителами к синаптическим белкам. а, б – Фрагменты дендритов нейронов, экспрессирующих EGFP (а) и fEGFP (б) (зеленое), окрашенные антителами к пресинаптическому белку синаптофизину (красное). Стрелками отмечены некоторые шипики, у которых головка соседствует с иммуноположительной меткой. в, г – Нейроны, трансфицированные плазмидами с EGFP и fEGFP, окрашенные антителами к постсинаптическому белку PSD95 (красное). Стрелками отмечены совпадения иммунореактивной метки с головкой шипика. Калибровка 5 мкм.

Скачать (890KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Скрипичные диаграммы, демонстрирующие распределения величин различных характеристик шипиков в нейронах, экспрессирующих EGFP и fEGFP. Толстая пунктирная линия показывает медиану, точечные линии – первые квартили. а – Длина шипиков; б – количество шипиков данного морфологического типа или колокализованных с иммунохимической меткой к синаптическому белку в процентах по отношению к общему количеству проанализированных шипиков; правая ось ординат. * – p < 0,05; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001; n.s. – различия недостоверны, критерий Стьюдента с поправкой Холма–Бонферони.

Скачать (283KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025