Подбор оптимальных pegRNA для повышения эффективности праймированного редактирования АТ-богатых участков генома

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Праймированное редактирование (PE) представляет собой перспективный подход для лечения наследственных заболеваний, поскольку он обладает повышенной эффективностью и безопасностью в сравнении с традиционными системами CRISPR/Cas9. Данное исследование сосредоточено на разработке этиотропной терапии муковисцидоза путем коррекции варианта F508del методом праймированного редактирования в гене CFTR, так как именно эта делеция является причиной значительной доли случаев заболевания. Хотя PE демонстрирует высокую эффективность внесения целевых изменений, метод трудно оптимизировать для AT-богатых регионов генома, в одном из которых расположен вариант F508del. Для решения этой проблемы мы систематически оценили 24 направляющие РНК и две различные системы PE – PEmax и PE2-NG. Эффективность коррекции варианта достигала 2,81% без пересчета на эффективность трансфекции в базальных клетках легкого пациентов с гомозиготным вариантом F508del. При этом эффективность трансфекции составила в среднем всего 11,9%, что подчеркивает критическую важность улучшения методов доставки. Наши результаты демонстрируют потенциал праймированного редактирования для лечения муковисцидоза, одновременно указывая на необходимость оптимизации как редактирующих конструкций, так и векторов доставки для достижения клинически значимых уровней коррекции.

Полный текст

Доступ закрыт

Об авторах

О. В. Володина

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Автор, ответственный за переписку.
Email: volodold@gmail.com
Россия, 115522 Москва

А. Г. Демченко

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Email: volodold@gmail.com
Россия, 115522 Москва

А. А. Анучина

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Email: volodold@gmail.com
Россия, 115522 Москва

О. П. Рыжкова

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Email: volodold@gmail.com
Россия, 115522 Москва

В. А. Ковальская

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Email: volodold@gmail.com
Россия, 115522 Москва

Е. В. Кондратьева

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Email: volodold@gmail.com
Россия, 115522 Москва

В. Ю. Табаков

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Email: volodold@gmail.com
Россия, 115522 Москва

А. В. Лавров

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Email: volodold@gmail.com
Россия, 115522 Москва

С. А. Смирнихина

ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

Email: volodold@gmail.com
Россия, 115522 Москва

Список литературы

  1. Xiao-Jie, L., Hui-Ying, X., Zun-Ping, K., Jin-Lian, C., and Li-Juan, J. (2015) CRISPR-Cas9: a new and promising player in gene therapy, J. Med. Genet., 52, 289-296, https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2014-102968.
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., and Barbas, C. F. (2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering, Trends Biotechnol., 31, 397-405, https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2013.04.004.
  3. Tröder, S. E., and Zevnik, B. (2022) History of genome editing: from meganucleases to CRISPR, Lab. Anim., 56, 60-68, https://doi.org/10.1177/0023677221994613.
  4. Uddin, F., Rudin, C. M., and Sen, T. (2020) CRISPR gene therapy: applications, limitations, and implications for the future, Front. Oncol., 10, 1387, https://doi.org/10.3389/fonc.2020.01387.
  5. Kantor, A., McClements, M. E., and MacLaren, R. E. (2020) CRISPR-Cas9 DNA base-editing and prime-editing, Int. J. Mol. Sci., 21, 6240, https://doi.org/10.3390/ijms21176240.
  6. Lee, J., Lim, K., Kim, A., Mok, Y. G., Chung, E., Cho, S.-I., Lee, J. M., and Kim, J.-S. (2023) Prime editing with genuine Cas9 nickases minimizes unwanted indels, Nat. Commun., 14, 1786, https://doi.org/10.1038/s41467-023-37507-8.
  7. Chow, R. D., Chen, J. S., Shen, J., and Chen, S. (2021) A web tool for the design of prime-editing guide RNAs, Nat. Biomed. Eng., 5, 190-194, https://doi.org/10.1038/s41551-020-00622-8.
  8. Hwang, G.-H., Jeong, Y. K., Habib, O., Hong, S.-A., Lim, K., Kim, J.-S., and Bae, S (2021) PE-Designer and PE-Analyzer: web-based design and analysis tools for CRISPR prime editing, Nucleic Acids Res., 49, W499-W504, https://doi.org/10.1093/nar/gkab319.
  9. Nelson, J. W., Randolph, P. B., Shen, S. P., Everette, K. A., Chen, P. J., Anzalone, A. V., An, M., Newby, G. A., Chen, J. C., Hsu, A., and Liu, D. R. (2022) Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency, Nat. Biotechnol., 40, 402-410, https://doi.org/10.1038/s41587-021-01039-7.
  10. Kiseleva, A., Klimushina, M., Sotnikova, E., Skirko, O., Divashuk, M., Kurilova, O., Ershova, A., Khlebus, E., Zharikova, A., Efimova, I., Pokrovskaya, M., Slominsky, P. A., Shalnova, S., Meshkov, A., and Drapkina, O. (2020) Cystic fibrosis polymorphic variants in a Russian population, Pharmgenomics Pers. Med., 13, 679-686, https://doi.org/10.2147/PGPM.S278806.
  11. Scotet, V., L’Hostis, C., and Férec, C. (2020) The changing epidemiology of cystic fibrosis: incidence, survival and impact of the CFTR gene discovery, Genes (Basel), 11, 589, https://doi.org/10.3390/genes11060589.
  12. Bobadilla, J. L., Macek, M., Fine, J. P., and Farrell, P. M. (2002) Cystic fibrosis: a worldwide analysis of CFTR mutations – correlation with incidence data and application to screening, Hum. Mutat., 19, 575-606, https://doi.org/10.1002/humu.10041.
  13. Регистр больных муковисцидозом в России, URL: https://mukoviscidoz.org/mukovistsidoz-v-rossii.html.
  14. De Boeck, K. (2020) Cystic fibrosis in the year 2020: a disease with a new face, Acta Paediatr., 109, 893-899, https://doi.org/10.1111/apa.15155.
  15. McKone, E. F., Ariti, C., Jackson, A., Zolin, A., Carr, S. B., Orenti, A., van Rens, J. G., Lemonnier, L., Macek, M., Keogh, R. H., Naehrlich, L., and European Cystic Fibrosis Society Patient Registry (2021) Survival estimates in European cystic fibrosis patients and the impact of socioeconomic factors: a retrospective registry cohort study, Eur. Respir. J., 58, 2002288, https://doi.org/10.1183/13993003.02288-2020.
  16. Амелина Е. Л., Черняк А. В., Черняев А. Л. (2001) Муковисцидоз: определение продолжительности жизни, Пульмонология, 61-64.
  17. Spoletini, G., Gillgrass, L., Pollard, K., Shaw, N., Williams, E., Etherington, C., Clifton, I. J., and Peckham, D. G. (2022) Dose adjustments of Elexacaftor/Tezacaftor/Ivacaftor in response to mental health side effects in adults with cystic fibrosis, J. Cyst. Fibros., 21, 1061-1065, https://doi.org/10.1016/j.jcf.2022.05.001.
  18. Papadakis, L., Stander, T., Mombourquette, J., Richards, C. J., Yonker, L. M., Lawton, B., Hardcastle, M., Zweifach, J., Sicilian, L., Bringhurst, L., and Neuringer, I. P. (2025) Heterogeneity in reported side effects following initiation of elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor: experiences at a quaternary CF care center, Pediatr. Pulmonol., 60, e27382, https://doi.org/10.1002/ppul.27382.
  19. Safety and Possible Side Effects|TRIKAFTA® (elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor and ivacaftor), URL: https:// www.trikafta.com/safety-side-effects.
  20. Kondrateva, E., Adilgereeva, E., Amelina, E., Tabakov, V., Demchenko, A., Ustinov, K., Yasinovsky, M., Voronina, E., Lavrov, A., and Smirnikhina, S. (2020) Generation of induced pluripotent stem cell line (RCMGi001-A) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with p.F508del mutation, Stem Cell Res., 48, 101933, https://doi.org/10.1016/j.scr.2020.101933.
  21. Kondrateva, E., Demchenko, A., Slesarenko, Y., Yasinovsky, M., Amelina, E., Tabakov, V., Voronina, E., Lavrov, A., and Smirnikhina, S. (2021) Derivation of iPSC line (RCMGi002-A) from dermal fibroblasts of a cystic fibrosis female patient with homozygous F508del mutation, Stem Cell Res., 53, 102251, https://doi.org/10.1016/ j.scr.2021.102251.
  22. Demchenko, A., Belova, L., Balyasin, M., Kochergin-Nikitsky, K., Kondrateva, E., Voronina, E., Pozhitnova, V., Tabakov, V., Salikhova, D., Bukharova, T., Goldshtein, D., Kondratyeva, E., Kyian, T., Amelina, E., Zubkova, O., Popova, O., Ozharovskaia, T., Lavrov, A., and Smirnikhina, S. (2024) Airway basal cells from human-induced pluripotent stem cells: a new frontier in cystic fibrosis research, Front. Cell. Dev. Biol., 12, 1336392, https://doi.org/10.3389/fcell.2024.1336392.
  23. Chen, P. J., Hussmann, J. A., Yan, J., Knipping, F., Ravisankar, P., Chen, P.-F., Chen, C., Nelson, J. W., Newby, G. A., Sahin, M., Osborn, M. J., Weissman, J. S., Adamson, B., and Liu, D. R. (2021) Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes, Cell, 184, 5635-5652.e29, https://doi.org/10.1016/ j.cell.2021.09.018.
  24. Kweon, J., Yoon, J.-K., Jang, A.-H., Shin, H. R., See, J.-E., Jang, G., Kim, J.-I., and Kim, Y. (2021) Engineered prime editors with PAM flexibility, Mol. Ther., 29, 2001-2007, https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2021.02.022.
  25. Clement, K., Rees, H., Canver, M. C., Gehrke, J. M., Farouni, R., Hsu, J. Y., Cole, M. A., Liu, D. R., Joung, J. K., Bauer, D. E., and Pinello, L. (2019) CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis, Nat. Biotechnol., 37, 224-226, https://doi.org/10.1038/s41587-019-0032-3.
  26. Anzalone, A. V., Randolph, P. B., Davis, J. R., Sousa, A. A., Koblan, L. W., Levy, J. M., Chen, P. J., Wilson, C., Newby, G. A., Raguram, A., and Liu, D. R. (2019) Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA, Nature, 576, 149-157, https://doi.org/10.1038/s41586-019-1711-4.
  27. Kim, D. Y., Moon, S. B., Ko, J.-H., Kim, Y.-S., and Kim, D. (2020) Unbiased investigation of specificities of prime editing systems in human cells, Nucleic Acids Res., 48, 10576-10589, https://doi.org/10.1093/nar/gkaa764.
  28. Fajrial, A. K., He, Q. Q., Wirusanti, N. I., Slansky, J. E., and Ding, X. (2020) A review of emerging physical transfection methods for CRISPR/Cas9-mediated gene editing, Theranostics, 10, 5532-5549, https://doi.org/10.7150/thno.43465.
  29. Johnson, L. G., Olsen, J. C., Sarkadi, B., Moore, K. L., Swanstrom, R., and Boucher, R. C. (1992) Efficiency of gene transfer for restoration of normal airway epithelial function in cystic fibrosis, Nat. Genet., 2, 21-25, https://doi.org/10.1038/ng0992-21.
  30. Ribeiro, S., Mairhofer, J., Madeira, C., Diogo, M. M., Lobato da Silva, C., Monteiro, G., Grabherr, R., and Cabral, J. M. (2012) Plasmid DNA size does affect nonviral gene delivery efficiency in stem cells, Cell Reprogram., 14, 130-137, https://doi.org/10.1089/cell.2011.0093.
  31. Felgner, P. L., Gadek, T. R., Holm, M., Roman, R., Chan, H. W., Wenz, M., Northrop, J. P., Ringold, G. M., and Danielsen, M. (1987) Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417.
  32. Bulcaen, M., Kortleven, P., Liu, R. B., Maule, G., Dreano, E., Kelly, M., Ensinck, M. M., Thierie, S., Smits, M., Ciciani, M., Hatton, A., Chevalier, B., Ramalho, A. S., Casadevall I Solvas, X., Debyser, Z., Vermeulen, F., Gijsbers, R., Sermet-Gaudelus, I., Cereseto, A., and Carlon, M. S. (2024) Prime editing functionally corrects cystic fibrosis-causing CFTR mutations in human organoids and airway epithelial cells, Cell Rep. Med., 5, 101544, https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2024.101544.
  33. Li, C., Liu, Z., Anderson, J., Liu, Z., Tang, L., Li, Y., Peng, N., Chen, J., Liu, X., Fu, L., Townes, T. M., Rowe, S. M., Bedwell, D. M., Guimbellot, J., and Zhao, R. (2023) Prime editing-mediated correction of the CFTR W1282X mutation in iPSCs and derived airway epithelial cells, PLoS One, 18, e0295009, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0295009.
  34. Sousa, A. A., Hemez, C., Lei, L., Traore, S., Kulhankova, K., Newby, G. A., Doman, J. L., Oye, K., Pandey, S., Karp, P. H., McCray, P. B., and Liu, D. R. (2025) Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells, Nat. Biomed. Eng., 9, 7-21, https://doi.org/ 10.1038/s41551-024-01233-3.
  35. Averina, O. A., Permyakov, O. A., Grigorieva, O. O., Starshin, A. S., Mazur, A. M., Prokhortchouk, E. B., Dontsova, O. A., and Sergiev, P. V. (2021) Comparative analysis of genome editors efficiency on a model of mice zygotes microinjection, Int. J. Mol. Sci., 22, 10221, https://doi.org/10.3390/ijms221910221.
  36. Bassai, L., Shigunov, P., and Soares, L. (2021) Correction of the mutation cause of cystic fibrosis (F508DEL) in pulmonary epithelius line cells BY CRISPR/CAS9, Cytotherapy, 23, 8, https://doi.org/10.1016/j.jcyt.2021.02.028.
  37. Smirnikhina, S. A., Kondrateva, E. V., Adilgereeva, E. P., Anuchina, A. A., Zaynitdinova, M. I., Slesarenko, Y. S., Ershova, A. S., Ustinov, K. D., Yasinovsky, M. I., Amelina, E. L., Voronina, E. S., Yakushina, V. D., Tabakov, V. Y., and Lavrov, A. V. (2020) P.F508del editing in cells from cystic fibrosis patients, PLoS One, 15, e0242094, https://doi.org/10.1371/journal.pone.0242094.
  38. Graham, C., and Hart, S. (2021) CRISPR/Cas9 gene editing therapies for cystic fibrosis, Expert Opin. Biol. Ther., 21, 767-780, https://doi.org/10.1080/14712598.2021.1869208.
  39. Pfeiffer, F., Gröber, C., Blank, M., Händler, K., Beyer, M., Schultze, J. L., and Mayer, G. (2018) Systematic evaluation of error rates and causes in short samples in next-generation sequencing, Sci. Rep., 8, 10950, https://doi.org/10.1038/s41598-018-29325-6.
  40. Ma, X., Shao, Y., Tian, L., Flasch, D. A., Mulder, H. L., Edmonson, M. N., Liu, Y., Chen, X., Newman, S., Nakitandwe, J., Li, Y., Li, B., Shen, S., Wang, Z., Shurtleff, S., Robison, L. L., Levy, S., Easton, J., and Zhang, J. (2019) Analysis of error profiles in deep next-generation sequencing data, Genome Biol., 20, 50, https://doi.org/10.1186/ s13059-019-1659-6.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Рибонуклеиновый комплекс для праймированного редактирования, подробное описание в тексте

Скачать (1MB)
Метаданные
3. Рис. 2. Схема сборки плазмидной конструкции с pegRNA

Скачать (1MB)
Метаданные
4. Рис. 3. Схема экспериментов для скрининга 24 pegRNA на БК легких двух пациентов с гомозиготным вариантом F508del в гене CFTR

Скачать (987KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Эффективность коррекции патогенного варианта после праймированного редактирования с использованием 24 pegRNA в БК легкого двух пациентов с гомозиготным вариантом F508del в гене CFTR. Генетические конструкции были доставлены электропорацией. На графике изображена средняя эффективность коррекции патогенного варианта в двух экспериментах. Планки погрешностей по оси Y отражают стандартную ошибку среднего; К – нетрансфицированный контроль

Скачать (636KB)
Метаданные
6. Рис. 5. Эффективность коррекции патогенного варианта после праймированного редактирования с использованием 7 показавших наибольшую эффективность pegRNA в БК легкого двух пациентов с гомозиготным вариантом F508del в гене CFTR. На графике показана эффективность редактирования в среднем каждой из pegRNA. Показаны объединенные данные по результатам экспериментов в двух биологических и трех технических повторностях на БК легких двух пациентов. Статистический анализ был проведен с использованием критерия Данна. Планки погрешностей по оси Y отражают стандартную ошибку среднего; К – нетрансфицированные клетки; * p < 0,05; *** p < 0,001

Скачать (552KB)
Метаданные
7. Рис. 6. Оценка нецелевых изменений ДНК после праймированного редактирования в образцах без целевой вставки CTT. На рисунке отображена анализируемая последовательность ДНК (с вариантом F508del), соответствующая ей аминокислотная последовательность (указана аминокислота и ее позиция в полипептидной цепи) и место внесения одноцепочечного разрыва при использовании pegRNA20, -21 и -22. Также представлен график, на котором видно распределение однонуклеотидных замен c.1528G>N, c.1529T>N, c.1531T>N и c.1531delT, внесенных при редактировании с использованием pegRNA20, -21 и -22. Планки погрешностей по оси Y отражают стандартную ошибку среднего

Скачать (862KB)
Метаданные
8. Рис. 7. Оценка нецелевых изменений ДНК после праймированного редактирования в образцах с целевой вставкой CTT. На рисунке отображена анализируемая последовательность ДНК (без варианта F508del), соответствующая ей аминокислотная последовательность (указана аминокислота и ее позиция в полипептидной цепи) и места внесения одноцепочечного разрыва при использовании различных pegRNA. а – Внесение изменений в целевую вставку при редактировании с использованием pegRNA1, -17, -19 и -20, планки погрешностей по оси Y отражают стандартную ошибку среднего. б – Распределение однонуклеотидных замен c.1528G>A, c.1529T>S и c.1531T>C, внесенных при редактировании с использованием pegRNA20, -21 и -22; планки погрешностей по оси Y отражают стандартную ошибку среднего

Скачать (845KB)
Метаданные

© Российская академия наук, 2025