Повышение уровня синтеза белка YciM позволяет снизить загрязнение эндотоксинами рекомбинантных белков, получаемых в Escherichia сoli

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Только для подписчиков

Аннотация

Загрязнение эндотоксинами рекомбинантных белков, полученных из Escherichia coli, в ряде случаев является достаточно серьёзной проблемой. Одним из путей её решения может быть использование специальных модифицированных штаммов со сниженным содержанием липополисахаридов (ЛПС). Мы сравнили два подхода к получению подобных штаммов. Первый достаточно широко известен и заключается в модификации метаболического пути синтеза ЛПС с помощью нокаута семи генов E. coli. Второй подход, ранее не применявшийся, основан на повышении экспрессии белка E. coli YciM. По литературным данным, повышение экспрессии YciM приводит к снижению количества белка LpxC, который является ключевым ферментом пути биосинтеза ЛПС. Мы решили проверить, приведёт ли коэкспрессия YciM и eGFP к снижению количества эндотоксинов в препаратах выделенного рекомбинантного eGFP. В итоге оба подхода показали сходный результат. И в том и в другом случае происходит падение количества эндотоксинов в препаратах очищенного модельного белка.

Об авторах

П. А Бобровский

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства;Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

119435 Москва, Россия;141701 Долгопрудный, Московская обл., Россия

Д. Д Харлампиева

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства

119435 Москва, Россия

С. А Кириллин

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства

119435 Москва, Россия

К. А Бровина

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства;Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

119435 Москва, Россия;141701 Долгопрудный, Московская обл., Россия

Е. Н Графская

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства

119435 Москва, Россия

В. Н Лазарев

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства;Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

119435 Москва, Россия;141701 Долгопрудный, Московская обл., Россия

В. А Манувера

Федеральный научно-клинический центр физико-химической медицины имени академика Ю.М. Лопухина Федерального медико-биологического агентства;Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)

Email: vmanuvera@yandex.ru
119435 Москва, Россия;141701 Долгопрудный, Московская обл., Россия

Список литературы

  1. Raetz, C. R., and Whitfield, C. (2002) Lipopolysaccharide endotoxins, Annu. Rev. Biochem., 71, 635-700, doi: 10.1146/annurev.biochem.71.110601.135414.
  2. Bos, M. P., Robert, V., and Tommassen, J. (2007) Biogenesis of the gram-negative bacterial outer membrane, Annu. Rev. Microbiol., 61, 191-214, doi: 10.1146/annurev.micro.61.080706.093245.
  3. Yoon, S. H., Jeong, H., Kwon, S. K., and Kim, J. F. (2009) Genomics, Biological Features, and Biotechnological Applications of Escherichia coli B: "Is B for better?!", in Systems Biology and Biotechnology of Escherichia coli (Lee, S. Y., ed), Springer, Dordrecht, doi: 10.1007/978-1-4020-9394-4_1.
  4. Mamat, U., Wilke, K., Bramhill, D., Schromm, A. B., Lindner, B., Kohl, T. A., Corchero, J. L., Villaverde, A., Schaffer, L., Head, S. R., Souvignier, C., Meredith, T. C., and Woodard, R. W. (2015) Detoxifying Escherichia coli for endotoxin-free production of recombinant proteins, Microb. Cell Fact., 14, 1-15, doi: 10.1186/s12934-015-0241-5.
  5. Kayagaki, N., Wong, M. T., Stowe, I. B., Ramani, S. R., Gonzalez, L. C., Akashi-Takamura, S., Miyake, K., Zhang, J., Lee, W. P., Muszyński, A., Forsberg, L. S., Carlson, R. W., and Dixit, V. M. (2013) Noncanonical inflammasome activation by intracellular LPS independent of TLR4, Science, 130, 1246-1249, doi: 10.1126/science.1240248.
  6. Park, B. S., Song, D. H., Kim, H. M., Choi, B. S., Lee, H., and Lee, J.-Oh (2009) The structural basis of lipopolysaccharide recognition by the TLR4-MD-2 complex, Nature, 458, 1191-1195, doi: 10.1038/nature07830.
  7. Mahalakshmi, S., Sunayana, M. R., Saisree, L., and Reddy, M. (2014) YciM is an essential gene required for regulation of lipopolysaccharide synthesis in Escherichia coli, Mol. Microbiol., 91, 145-157, doi: 10.1111/mmi.12452.
  8. Jiang, Y., Chen, B., Duan, C., Sun, B., Yang, J., and Yang, S. (2015) Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system, Appl. Environ. Microbiol., 81, 2506-2514, doi: 10.1128/AEM.04023-14.
  9. Klock, H. E., and Lesley, S. A. (2009) The Polymerase Incomplete Primer Extension (PIPE) method applied to high-throughput cloning and site-directed mutagenesis, Methods Mol. Biol., 498, 91-103, doi: 10.1007/978-1-59745-196-3_6.
  10. Dower, W. J., Miller, J. F., and Ragsdale, C. W. (1988) High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation, Nucleic Acids Res., 16, 6127-6145, doi: 10.1093/nar/16.13.6127.
  11. Cormack, B. P., Valdivia, R. H., and Falkow, S. (1996) FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP), Gene, 173, 33-38, doi: 10.1016/0378-1119(95)00685-0.
  12. Mamat, U., Woodard, R. W., Wilke, K., Souvignier, C., Mead, D., Steinmetz, E., Terry, K., Kovacich, Ch., Zegers, A., and Knox, C. (2013) Endotoxin-free protein production - ClearColiTM technology, Nat. Methods, 10, 916, doi: 10.1038/nmeth.f.367.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Российская академия наук, 2023