Оптимизация продукции рекомбинантного аденоассоциированного вируса 9 серотипа

Обложка

Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) зарекомендовали себя как удобный инструмент геномного редактирования. Однако для трансгенеза лабораторных животных или генной терапии заболеваний человека требуется высокий титр AAV, в получении которого заключается основная трудность. Мы провели оптимизацию условий получения AAV серотипа 9 (AAV9) с целью повышения выхода вируса. Широко распространенный подход подразумевает трансфекцию клеток-продуцентов тремя плазмидами. Мы провели трансфекцию двумя плазмидами, кодирующими все необходимые компоненты для продукции AAV9. Это позволило повысить итоговый титр в четыре раза. Оптимизация по молярному соотношению плазмиды, содержащей ген интереса, и плазмиды, кодирующей белки репликативного комплекса, капсида и вспомогательных факторов, привела к двукратному повышению титра. Оптимизация состава производственной среды для продукции ААV9 позволила существенно повысить выход вируса. При замене производственной среды DMEM-F12 на менее питательную – DMEM – с добавкой эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота выход AAV9 увеличился почти на 3 порядка. Таким образом, оптимизация числа и соотношения плазмид, а также состава производственной среды позволили многократно повысить продукцию ААV9 и достичь итогового титра в 2.5 × 1012 векторных геномов в 1 мл культуральной среды адгезивных клеток линии HEK293Т.

Об авторах

Т. И. Алиев

Новосибирский государственный университет; Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор” Роспотребнадзора

Email: aliev.timur99@yandex.ru
Новосибирск, 630090 Россия; р. п. Кольцово, Новосибирская область, 630559 Россия

И. Р. Иматдинов

Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии “Вектор” Роспотребнадзора

Email: imatdinov_ir@vector.nsc.ru
р. п. Кольцово, Новосибирская область, 630559 Россия

Список литературы

  1. Issa S.S., Shaimardanova A.A., Solovyeva V.V., Rizvanov A.A. (2023) Various AAV serotypes and their applications in gene therapy: an overview. Cells. 12, 785.
  2. Wang D., Tai P.W.L., Gao G. (2019) Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 18, 358–378.
  3. McCarty D.M. (2008) Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Mol. Ther. 16, 1648–1656.
  4. Lunev E., Karan A., Egorova T., Bardina M. (2022) Adeno-associated viruses for modeling neurological diseases in animals: achievements and prospects. Biomedicines. 10, 1140.
  5. Li C., Samulski R.J. (2020) Engineering adeno-associated virus vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 21, 255–272.
  6. Brommel C.M., Cooney A.L., Sinn P.L. (2020) Adeno-associated virus-based gene therapy for lifelong correction of genetic disease. Hum. Gene Ther. 31, 985–995.
  7. Pupo A., Fernández A., Low S.H., François A., Suárez-Amarán L., Samulski R.J. (2022) AAV vectors: the Rubik’s cube of human gene therapy. Mol. Ther. 30, 3515–3541.
  8. Wang J.H., Gessler D., Zhan W., Gallagher L., Gao G. (2024) Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal. Transduct. Target Ther. 9, 78.
  9. Ayuso E, Mingozzi F, Bosch F. (2010) Production, purification and characterization of adeno-associated vectors. Curr. Gene Ther. 10, 423–436.
  10. Guan J.S., Chen K., Si Y., Kim T., Zhou Z., Kim S., Zhou L., Liu X.M. (2022) Process improvement of adeno-associated virus (AAV) production. Front. Chem. Eng. 4, 830421.
  11. Kimura T., Ferran B., Tsukahara Y., Shang Q., Desai S., Fedoce A., Pimentel D.R., Luptak I., Adachi T., Ido Y., Matsui R., Bachschmid M.M. (2019) Production of adeno-associated virus vectors for in vitro and in vivo applications. Sci. Rep. 9, 13601.
  12. Воробьев П.О., Кочетков Д.В., Василенко К.В., Липатова А.В. (2022) Сравнительный анализ эффективности общедоступных методов трансфекции модельных клеточных линий для задач биотехнологии. Вестник РГМУ. 3, 11–19. https://doi.org/10.24075/vrgmu.2022.031
  13. Zhao H., Lee K.J., Daris M., Lin Y., Wolfe T., Sheng J., Plewa C., Wang S., Meisen W.H. (2020) Creation of a high-yield AAV vector production platform in suspension cells using a design-of-experiment approach. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 18, 312–320.
  14. Aurnhammer C., Haase M., Muether N., Hausl M., Rauschhuber C., Huber I., Nitschko H., Busch U., Sing A., Ehrhardt A., Baiker A. (2012) Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum. Gene Ther. Methods. 23, 18–28.
  15. Bennett A., Mietzsch M., Agbandje-McKenna M. (2017) Understanding capsid assembly and genome packaging for adeno-associated viruses. Future Virol. 12, 283–297.
  16. Guan J.S., Chen K., Si Y., Kim T., Zhou Z., Kim S., Zhou L., Liu X.M. (2022) Process improvement of adeno-associated virus (AAV) production. Front. Chem. Eng. 4, 830421.
  17. Ohba K., Mizukami H. (2023) Protocol for producing an adeno-associated virus vector by controlling capsid expression timing. STAR Protoc. 4, 102542.
  18. Yang J., Zhou W., Zhang Y., Zidon T., Ritchie T., Engelhardt J.F. (1999) Concatamerization of adeno- associated virus circular genomes occurs through intermolecular recombination. J. Virol. 73, 9468–9477.
  19. Grieger J.C., Soltys S.M., Samulski R.J. (2016) Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol. Ther. 24, 287–297.
  20. Chaudhry M.A., Vitalis T.Z., Bowen B.D., Piret J.M. (2008) Basal medium composition and serum or serum replacement concentration influences on the maintenance of murine embryonic stem cells. Cytotechnology. 58, 173–179.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Российская академия наук, 2025