Биохимия

В данном обзоре рассматриваются современные подходы к изучению репарации двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) в клетках млекопитающих с использованием системы CRISPR/Cas9. Благодаря своей универсальности и эффективности эндонуклеаза Cas9 применяется во множестве генетических репортёров. Мы обсуждаем различные репортёры, основанные на флуоресценции, применяемые для мониторинга процесса восстановления. Также среди инновационных подходов на основе Cas9 особое внимание уделяется методам анализа как одиночных, так и множественных DSB, включая подходы DSB-TRIP и ddXR. Эти методы открывают новые возможности для исследования причин структурных перестроек или анализа любых геномных участков. Кроме того, в обзоре рассматривается, чем DSB, индуцированные Cas9, отличаются от DSB, создаваемых другими эндонуклеазами, и как эти особенности могут повлиять на механизмы восстановления ДНК. Понимание этих различий имеет решающее значение для планирования экспериментов, направленных на изучение репарации DSB.

Th2-цитокины (IL-4, IL-5 и IL-13) играют важную роль в развитии аллергии и аллергического ринита (АР), в частности IL-13 стимулирует гиперпродукцию слизи в дыхательных путях, а IL-5 привлекает эозинофилы в слизистую оболочку носа, которые усиливают воспаление и повреждение тканей. Для лечения аллергических заболеваний разрабатываются препараты на основе моноклональных антител, блокирующие действие этих цитокинов. Однако исследования с использованием препаратов, подавляющих только IL-13 (например, Tralokinumab и Lebrikizumab), не показали значительного улучшения. Учитывая, что IL-5 и IL-13 играют разные роли в развитии АР, перспективным подходом может стать одновременное подавление этих цитокинов. Новые методы регуляции активности генов, например РНК-интерференция (РНКи), открывают дополнительные перспективы в создании лекарственных препаратов. В работе описан комплекс, состоящий из молекул миРНК, подавляющий активность генов Il5 и Il13, и пептида-носителя LTP. Изучен эффект комплекса на развитие аллергического воспаления в модели АР у мышей. Подавление экспрессии Il5 уменьшило назальную гиперреактивность и количество бокаловидных клеток в респираторном эпителии мышей с индуцированным АР. Ингибирование гена Il13 продемонстрировало более выраженное терапевтическое действие по сравнению с подавлением Il5, дополнительно способствуя уменьшению инфильтрации клеток в слизистую оболочку носовой полости. Одновременное подавление генов Il5 и Il13 дало результат, аналогичный ингибированию только Il13. Это позволяет сделать вывод о том, что IL-13 играет более значимую роль в развитии аллергического ринита по сравнению с IL-5. В итоге продемонстрирована возможность использования РНКи для антицитокиновой терапии АР. Одновременная инактивация IL-5 и IL-13 молекулами миРНК не дает преимуществ, согласно используемым в данном исследовании критериям оценки, по сравнению с инактивацией только IL-13. Однако отсутствие успеха анти-IL-13-терапии в клинической практике указывает на перспективность подхода, основанного на комбинированной блокировке IL-5 и IL-13.

В работе исследована эволюция систем рестрикции-модификации, белки которых содержат эндонуклеазный домен семейства RE_AlwI и либо две ДНК-метилтрансферазы, каждая с доменом семейства MethyltransfD12, либо одну ДНК-метилтрансферазу с двумя доменами этого семейства. Все такие системы узнают одну из трёх последовательностей ДНК, а именно GGATC, GATGC или GATGG, а эндонуклеазы рестрикции этих систем разделяются по сходству полных последовательностей на три клады, однозначно соответствующие специфичностям. ДНК-метилтрансферазные домены этих систем по сходству последовательностей делятся на две группы, причём два домена каждой системы относятся к разным группам, а в пределах каждой группы домены разделяются на три клады, соответствующие специфичности. Обнаружены признаки множественных межвидовых горизонтальных переносов систем в целом, а также свидетельства переноса генов между системами, в том числе переноса одной из ДНК-метилтрансфераз с изменением специфичности. Выявлены эволюционные связи ДНК-метилтрансфераз из таких систем с другими, в том числе одиночными, ДНК-метилтрансферазами.

Было изучено влияние солевого стресса в хлоропластах мезофилла (М) и обкладки (ОБ) растений кукурузы, подвергавшихся обработке NaCl в течение 5 дней. Содержание пигментов, флуоресценция хлорофилла при 77 К, активность фотосистем (ФС) I и II, полипептидный состав и ультраструктура тилакоидных мембран определялись в растениях, выращенных в условиях различной солёности (0, 100, 200 и 250 мМ NaCl). Обработка солью вызывала снижение флуоресценции, фотохимической активности ФСII и ФСI, а также содержания белка в тилакоидах. При высоких концентрациях соли отношение интенсивности флуоресценции на длинах волн 735 и 686 нм (F735/F686) в хлоропластах М снижалось, а в хлоропластах ОБ стимулировалось. Фотохимическая активность ФСII была снижена в обоих типах хлоропластов, в то время как статистически значимой разницы в активности ФСI по сравнению с контролем не наблюдалось. По данным анализа белкового состава тилакоидных мембран хлоропластов М и ОБ, полипептиды, принадлежащие к ядерной антенне ФСII (47 кДа и 43 кДа) и светособирающему комплексу ФСII (ССКII, 28–24 кДа), присутствовали в обоих типах мембран, но их интенсивность была слабой в тилакоидах ОБ. Синтез апобелка 68 кДа, входящего в состав ядра ФСI, в мембранах тилакоидов М был ингибирован. Заметных изменений в мембранной системе тилакоидов ОБ не наблюдалось. Солевой стресс оказал более значительное влияние на ультраструктуру хлоропластов М, чем хлоропластов ОБ, и вызвал формирование гранальной структуры в хлоропластах ОБ. Полученные результаты могут свидетельствовать о различном ответе двух типов хлоропластов на солевой стресс.