Биологические мембраны

Специфические паттерны распределения различных липидов в клеточных мембранах определяют их структурные и сигнальные роли, а также обеспечивают целостность и функциональность цитоплазматической мембраны и клеточных органелл. Последние достижения в области создания рекомбинантных липидных биосенсоров и методов визуализации позволяют напрямую наблюдать распределение, перемещение и динамику липидов в клетке, что заметно продвинуло понимание функции липидов и реакций с их участием как на клеточном, так и на субклеточном уровнях. В данном обзоре мы обобщили данные, касающиеся разработок в области проектирования и применения рекомбинантных белковых сенсоров к различным липидам клеточных мембран.

Перенос протонов между границей мембраны и водой может быть затруднен из-за наличия высокого потенциального барьера, что влияет на их транспорт через мембрану мембранными белками. Для оценки скорости переноса протонов через этот барьер используют фотоактивируемые соединения, молекулы которых могут адсорбироваться на границе мембраны и освобождать протоны при возбуждении. Нами изучалось такое соединение – 2-метокси-5-нитрофенилсульфат натрия (MNPS). Его молекула способна адсорбироваться на бислойной липидной мембране (БЛМ) в виде аниона и при возбуждении УФ светом освобождать сульфат и протон, превращаясь в электронейтральный продукт. При освещении БЛМ, с одной стороны которой были адсорбированы анионы MNPS, наблюдались изменения электростатического потенциала на границе мембраны с водой. Медленные изменения потенциала измеряли методом компенсации внутримембранного поля, быстрые – с помощью электрометрического усилителя. При включении света происходило быстрое возрастание потенциала, при выключении – его медленный возврат к первоначальному значению. Скорость быстрого возрастания потенциала зависела от липидного состава БЛМ, концентрации буфера и рН среды. Зависимость этой скорости от рН была различной для БЛМ, сформированных из фосфатидилхолина и его смеси с фосфатидилсерином. При увеличении концентрации буфера скорость уменьшалась в десятки раз. Полученные результаты свидетельствуют о том, что реакция выделения протонов, образовавшихся при возбуждении молекул MNPS, происходит как на поверхности мембраны, так и в воде около нее. Протоны, образующиеся в воде и связавшиеся на БЛМ, дают основной вклад в изменение электростатического потенциала на границе мембраны, значительно превышающий вклад анионов MNPS, уходящих с мембраны в раствор.

Контролируемое образование сквозных пор в бислойных липидных мембранах является ключевой стадией различных биотехнологических методик. Избыточная энергия кромки поры характеризуется линейным натяжением, величина которого определяет общую стабильность мембраны по отношению к образованию пор. Практически важный размер пор составляет порядка нескольких нанометров. Исследование таких пор прямыми оптическими методами невозможно, однако они, в принципе, могут быть визуализированы методом атомно-силовой микроскопии. В этом методе используется твердая подложка, на которой липидный бислой удерживается за счет взаимодействия с ней одного из монослоев. В настоящей работе мы теоретически исследовали влияние наличия подложки на величину линейного натяжения кромки поры. Предполагалось, что линейное натяжение определяется энергией упругих деформаций мембраны на кромке. Были рассмотрены различные режимы взаимодействия мембраны с подложкой: от свободной мембраны (полное отсутствие взаимодействия) до случая бесконечно сильной адгезии мембраны на подложку. Результаты расчетов показывают, что относительное изменение линейного натяжения кромки поры при такой вариации интенсивности взаимодействия мембраны с подложкой оказывается менее 3.5%. Таким образом, разработанная теоретическая модель предсказывает чрезвычайно слабое влияние взаимодействия с подложкой на величину линейного натяжения – основную энергетическую характеристику кромки поры.

Несмотря на то что в настоящее время ситуация с заболеваемостью COVID-19 не является чрезвычайной, в мире продолжают появляться все новые штаммы коронавируса SARS-CoV-2, некоторые из них обладают большей вирулентностью по сравнению с исходным вирусом. Исследования показали, что высокий риск тяжелого течения COVID-19 имели пациенты, страдающие болезнью Альцгеймера (БА), однако молекулярно-клеточный механизм такой предрасположенности не до конца выяснен. В данной работе была разработана клеточная модель начальной стадии COVID-19 на первичной культуре гиппокампа мышей 5xFAD, модели семейной формы БА, с использованием специфического ингибитора АСЕ2-рецептора MLN-4760. В основу этой модели положен экспериментально доказанный факт снижения активности рецепторов АСЕ2, которое наблюдается у пациентов с COVID-19 вследствие интернализации рецептора внутрь клетки после связывания с коронавирусом. С использованием иммунохимического окрашивания специфическими антителами для выявления нейронов (маркер МАР2) и астроглии (маркер GFAP) установлено, что через 24 ч после добавления в культуральную среду MLN-4760 (0.2 нмоль на 1 мл среды) отмечалось уменьшение плотности астроцитов и нейронов, изменение их морфологии с резким сокращением длины и плотности нейритов, что приводило к гибели клеточной культуры. При этом трансгенная культура оказалась более чувствительна к воздействию ингибитора по сравнению с контрольной культурой гиппокампа нативных мышей. Во второй части исследования были изучены возможности предотвращения разрушительного действия MLN-4760 на состояние гиппокампальной культуры. Показано, что применение YB-1, эндогенного полифункционального стресс-белка, способствовало восстановлению структуры культуры клеток и приводило к стимуляции роста нейритов и активации астроглии. Введение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) после блокады АСЕ2 также сопровождалось улучшением выживаемости культур, восстановлением морфологии клеток, увеличением плотности астроцитов и нейронов. Полученные результаты свидетельствуют, что YB-1 и клеточная терапия с использованием ММСК являются перспективными вариантами для разработки новых эффективных методов предотвращения патологического влияния вируса на мозговую ткань, что является важным звеном в лечении инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2.