Molecular BiologyMolecular BiologyМолекулярная биология0026-89843034-5553The Russian Academy of Sciences69968310.7868/S3034555325060119МЕТОДЫResearch ArticleSimultaneous Incorporation of Different Cy5-Labeled Deoxypyrimidine Nucleotides into the Synthesized DNA ChainОДНОВРЕМЕННОЕ ВСТРАИВАНИЕ РАЗНОИМЕННЫХ СУБ-МЕЧЕНЫХ ДЕЗОКСИПИРИМИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ В СИНТЕЗИРУЕМУЮ ЦЕПЬ ДНКMonakovaP. MМонаковаП. Мemail@example.comShershovV. EШершовВ. Еemail@example.comSurzhikovS. AСуржиковС. Аemail@example.comGrechishnikovaI. VГречишниковаИ. Вemail@example.comLapaS. AЛапаС. Аlapa@biochip.ruChudinovA. VЧудиновА. Вemail@example.comEngelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of SciencesИнститут молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук25122025596VOL 59, NO6 (2025)ТОМ 59, №6 (2025)1022102827122025Copyright ©; 2025, Russian Academy of SciencesCopyright ©; 2025, Российская академия наук2025Russian Academy of SciencesРоссийская академия наукhttps://vietnamjournal.ru/0026-8984/article/view/699683

In PCR with Taq polymerase on the Staphylococcus aureus genomic DNA template, the substrate properties of eight fluorescently labeled deoxyuridine and deoxycytidine triphosphates (Cy5-dUTP and Cy5-dCTP), which are dU-dC pairs with similar cyanine substituents, was compared during simultaneous introduction of the such pairs in PCR. The different Cy5-dUTP and Cy5-dCTP pairs differed from each other in that each of them had substituents with different linker lengths between the nitrogenous base and the fluorophore, as well as the linker lengths between the quaternary ammonium group and the second heterocycle of the Cy5 fluorophore. The amplification efficiency, as well as the yield of the product, and the density of label incorporation were determined. It was found that with the simultaneous introduction of Cy5-modified dU and dC into the reaction at equimolar concentrations, the inhibitory effect was not directly proportional to the concentration, in contrast to that with separate (individual) introduction of fluorescently labeled dNTPs. This allows one to use the simultaneous introduction of Cy5-modified dU and dC into PCR to increase sensitivity in methods based on the detection of a fluorescent signal, for example, in DNA-microarray technology.

В ПЦР с Таq-полимеразой на геномной ДНК Staphylococcus aureus сравнивали субстратную эффективность восьми флуоресцентно меченных дезоксиуридин- и дезоксицитидинтрифосфатов (Cy5-dUTP и Cy5-dCTP), представляющих собой пары (dU и dC) с аналогичными цианиновыми заместителями, при одновременном введении таких пар в реакцию. Различные пары Cy5-dUTP и Cy5-dCTP отличались между собой тем, что в каждой из них были заместители с различной длиной линкера между азотистым основанием и флуорофором, а также длиной линкера между четвертичной аммониевой группой и вторым гетероциклом Cy5-флуорофора. Определяли показатели эффективности амплификации, а также выход целевого продукта и плотность встраивания метки в ПЦР-продукт. Обнаружено, что при одновременном введении в реакцию Cy5-модифицированных dU и dC в эквимолярных концентрациях ингибирующий эффект не подчинялся прямо пропорциональной зависимости от концентрации – в отличие от таковой при раздельном (индивидуальном) введении флуоресцентно меченных dNTPs. Это позволяет использовать одновременное введение Cy5-модифицированных dU и dC в ПЦР для увеличения чувствительности в методах, основанных на детекции флуоресцентного сигнала, например в технологии ДНК-микрочипов.

fluorescently labeled nucleoside triphosphatessubstrate efficiencyPCRkineticsфлуоресцентно меченные нуклеозидтрифосфатысубстратная эффективностьПЦРкинетика амплификацииРабота поддержана грантом Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение № 075-15-2025-285).Lee M.A., Siddle A.L., Page R.H. (2002) ResonSense®: simple linear fluorescent probes for quantitative homogenous rapid polymerase chain reaction. *Analytica Chimica Acta*. **457**, 61–70.Yu H., Chao J., Patek D., Mujumdar R., Mujumdar S., Waggoner A.S. (1994) Cyanine dye dUTP analogs for enzymatic labeling of DNA probes. *Nucleic Acids Res*. **22**, 3226–3232.Abdirassilova A.A., Abdel Z.Z.H., Kurmanov B.K., Kassenova A.K., Rysbekova A.K., Yessimesti D.T., Abdeliyev B.Z., Meka Mechenko T.V., Dalibayev Z.H.S., Beginnbayeva E.Z.H. (2020) Development of a real-time PCR using fluorescent hybridization probes. *J. Res. Med. Dent. Sci*. **8**, 26–36.Navarro E., Serrano-Heras G., Castano M.J., Solera J. (2015) Real-time PCR detection chemistry. *Clin. Chim. Acta*. **439**, 231–250.Proudnikov D., Yuferov V., Zhou Y., LaForge K.S., Ho A., Kreek M.J. (2003) Optimizing primer-probe design for fluorescent PCR. *J. Neurosci. Methods*. **123**, 31–45.Lehnert M., Kipf E., Schlenker F., Borst N., Zengerle R., von Stetten F. (2018) Fluorescence signal-to-noise optimisation for real-time PCR using universal reporter oligonucleotides. *Analytical Methods*. **10**, 3444–3454.Spitsyn M.A., Kuznetsova V.E., Shershov V.E., Emelyanova M.A., Guseinov T.O., Lapa S.A., Nasedkina T.V., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. (2017) Synthetic route to novel zwitterionic pentamethine indocyanine fluorophores with various substitutions. *Dyes Pigments*. **147**, 199–210.Шершов В.Е., Лапа С.А., Левашова А.И., Шишкин И.Ю., Штылев Г.Ф., Щекалова Е.Ю., Василисков В.А., Заседателев А.С., Кузнецова В.Е., Чудинов А.В. (2023) Синтез флуоресцентно-меченых нуклеотидов для маркирования продуктов изотермической амплификации. *Биоорг. химия*. **49**, 649–656.Ramakers C., Ruijter J.M., Deprez R.H., Moorman A.F. (2003) Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data. *Neurosci. Lett*. **339**, 62–66.Peirson S.N., Butler J.N., Foster R.G. (2003) Experimental validation of novel and conventional approaches to quantitative real-time PCR data analysis. *Nucleic Acids Res*. **31**, e73.Sambrook J., Russell D.W. (2001) Preparing denatured double-stranded DNA templates for sequencing by didcoxy-mediated chain termination. In: *Molecular Cloning: A Laboratory Manual*, 3rd ed., vol. 2, Ch. 12. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, pp. 12–26–12–30.Monakova P.M., Shershov V.E., Kuznetsova V.E., Chudinov A.V., Lapa S.A. (2025) Substrate behavior of dissimilar Cy5-deoxypyrimidine nucleotides in PCR with DNA templates of different GC compositions. *Mol. Biol*. **59**, 116–122. https://doi.org/10.1134/S0026893324700754Shershov V.E., Lapa S.A., Kuznetsova V.E., Spitsyn M.A., Guseinov T.O., Polyakov S.A., Stomahin A.A., Zasedatelev A.S., Chudinov A.V. (2017) Comparative study of novel fluorescent cyanine nucleotides: hybridization analysis of labeled PCR products using a biochip. *J. Fluoresc*. **27** (6), 2001–2016.